心力衰竭已成为全球心血管疾病的沉重负担^[1]，而心脏出生后的成熟过程对维持正常功能至关重要。长期以来，人们对心脏成熟调控机制的认知多聚焦于单一细胞或通路，缺乏全器官层面的系统解析。一项发表在Developmental Cell期刊上题为RNA splicing controls organ-wide maturation of postnatal heart in mice的研究，通过单细胞RNA测序技术，首次揭示了RNA剪接在小鼠心脏出生后全器官成熟中的关键调控作用，为心脏发育和再生研究带来重大突破！

图1 论文题目及作者

哺乳动物出生后，心脏需经历从胚胎型到成熟型的剧烈转变，包括细胞结构重塑、代谢模式切换及功能完善^[2]。此前研究多聚焦于心肌细胞的成熟调控，却忽视了成纤维细胞、内皮细胞等非心肌细胞的作用，且缺乏对全器官层面统一调控机制的解析。

RNA选择性剪接（AS）作为基因表达调控的核心机制，在人类约90%-95% 的基因都会发生^[3]。AS与心脏发育和疾病相关，但不同心脏细胞是否存在统一AS 调控程序仍是未解之谜。此研究正是瞄准这一科学空白，展开深入探索。

研究团队首先采用ICELL8单细胞测序平台（Takara Bio Japan），对小鼠出生后的关键阶段（P1-P7、P10、P14、P28）及胚胎期（E18.5）的心脏组织进行分析，构建了高分辨率的单细胞转录组图谱。

图2 scRNA-seq实验设计和样品收集策略示意图

研究团队将心脏发育划分为三个阶段：早期（E18.5、P1-P3）、中期（P4-P7）和晚期（P10、P14、P28），并最终筛选出31490个高质量细胞用于后续分析。这些细胞鉴定为12种主要细胞类型，包括心肌细胞（CM）、内皮细胞（EC）、成纤维细胞（FB）和巨噬细胞（MP）等，每个细胞平均测序深度达60万条读数，可检测基因3949个，严格的质量控制确保了数据可靠性。

图3 细胞聚类和类型分布图

细胞间通讯分析揭示，不同阶段细胞互作模式差异显著：

• 早期→中期：心肌细胞与免疫细胞互作显著增强（占上调互作的23.56%和79.73%），血管细胞互作减弱（占下调互作的80.88%），提示出生后初期，免疫细胞可能参与心脏“启动成熟”；

• 中期→晚期：血管细胞互作增加（占上调互作的74.83%），免疫细胞互作减少（占下调互作的66.21%），表明血管网络重构是晚期成熟的核心事件。

图4 细胞间相互作用在所有细胞类型中的变化

信号通路研究显示，胚胎心脏发育的关键通路Notch信号随心脏成熟逐渐减弱，而成纤维细胞生长因子（FGF）信号持续增强，成为维持心脏稳态的“保护屏障”，这一发现为理解心脏成熟的信号调控网络提供了关键线索。

图5 心脏发育过程中不同阶段的Notch和FGF信号通路

为了探究RNA剪接的作用，研究团队对6210个AS事件进行分析发现，外显子跳跃（SE）是最主要的AS类型（占比54.6%），随后聚焦SE事件展开研究。

与胚胎期（E18.5）相比，出生后P1期SE状态发生显著重构，第一周末（P7）相对稳定，P10-P28再次显著变化；而基因表达呈渐进式变化，与AS图谱动态存在明显差异，提示AS更灵敏反映成熟阶段。

图6 不同时间点每种细胞PSI值的Pearson相关系数

基于SE事件的PSI值（剪接纳入百分比）进行聚类，细胞按发育阶段清晰分组；基于差异表达基因（DEG）聚类，细胞则按类型分组。UMAP分析进一步证实，SE图谱能明确区分不同发育时间点，而基因表达图谱无法实现。

图7 不同时间点主要细胞类型中差异SE事件PSI值的细胞无监督分层聚类

图8 UMAP通过剪接事件的PSI值可视化细胞聚类

通过RT-PCR验证，Luc7l（参与肌生成的剪接因子）随成熟外显子2跳跃增加，PSI值降低；甲状腺激素受体相关蛋白3（Thrap3，一种RNA结合蛋白）随着成熟外显子11-12纳入增加，PSI值升高，与测序结果完全一致。

图9 Luc7l和Thrap3的密度变化及RT-PCR验证

RNA剪接由RNA结合蛋白（RBP）调控。研究团队通过motif富集分析和差异表达分析，筛选出69个核心RBP，其中核帽结合蛋白亚基2（NCBP2）表现突出，进一步验证其在心脏成熟中的功能。

在新生心肌细胞中敲低NCBP2能显著抑制细胞增殖，增加肌原纤维束宽度和肌节长度，改善电生理功能（如缩短动作电位时程、提高去极化速度），促进心肌细胞结构和功能成熟。而在成年心肌细胞中过表达NCBP2，会导致心肌细胞成熟特征部分逆转。

图10 敲低NCBP2促进心肌细胞成熟

RNA-seq分析显示，NCBP2敲低对心肌细胞转录组的影响主要体现在剪接水平而非转录水平。NCBP2敲低的新生心肌细胞，其SE图谱与成年心肌细胞更相似；而NCBP2过表达的成年心肌细胞SE图谱向新生心肌细胞特征偏移。

图11 RNA结合蛋白NCBP2通过调节选择性剪接控制心肌细胞成熟

通过CLIP-seq鉴定NCBP2的直接结合靶标，与差异剪接基因（DSG）重叠得到311个（敲低）和239个（过表达）核心靶基因，这些基因富集于肌细胞发育和细胞骨架组织等心脏成熟相关通路。进一步筛选出91个共同靶基因，包括心脏成熟相关基因Ttn、Camk2d等，其剪接模式在NCBP2敲低和过表达时呈相反变化。

图12 重叠基因的基因功能富集

为验证NCBP2在体内的功能，研究团队通过腺相关病毒（AAV）在新生小鼠（P1）心脏中过表达NCBP2，观察心脏成熟过程。

图13 动物实验的工作流程图

NCBP2过表达导致小鼠心脏射血分数（EF）显著升高（2周时由80.26%升至90.36%，5周时由55.38%升高至73.01%），左心室前壁厚度增加，与心脏成熟延迟表型一致。

图14 NCBP2过表达导致小鼠早期心脏成熟受到抑制

NCBP2过表达显著增加了心肌细胞增殖标志物（MKI67、AURKB）的阳性率；成纤维细胞早期标志物（FABP4）表达增加，晚期标志物（EGR1）表达减少，表明多种心脏细胞成熟受阻。

图15 NCBP2过表达导致小鼠多种心肌细胞成熟受到抑制

NCBP2过表达导致129个配体-受体对上调，88个下调，其中94.4%的优势信号通路为早期和中期特异性通路，维持未成熟的细胞通讯模式。

图16 NCBP2过表达后四种细胞类型中细胞相互作用和信号通路变化

此项研究首次从全器官、单细胞、转录本异构体层面，证实RNA剪接是心脏成熟的“统一调控机制”，NCBP2等RBP通过调控剪接，协调心肌细胞与非心肌细胞共同完成成熟过程。这一发现不仅填补了心脏成熟调控机制的空白，更为心力衰竭的治疗提供了精准靶向的新思路，为心血管疾病患者带来新希望！

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图17 ICELL8CX系统  图源：百洋智心

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参考文献：

1.Greene, S.J., et al., Worsening Heart Failure: Nomenclature, Epidemiology, and Future Directions: JACC Review Topic of the Week. J Am Coll Cardiol, 2023. 81(4): p. 413-424.

2.Bassat, E., et al., The extracellular matrix protein agrin promotes heart regeneration in mice. Nature, 2017. 547(7662): p. 179-184.

3. Pan, Q., et al., Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet, 2008. 40(12): p. 1413-5.